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天津本生ELISA 實驗的一些原理總結(jié)
更新時間:2021-12-14瀏覽:1726次

  天津本生ELISA 實驗的一些原理總結(jié)


  ELISA  即酶聯(lián)免疫吸附測定,是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,然后利用酶標記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育,加入顯色劑顯色,通過酶標儀測定待測物顏色與標準物顏色的差異,繪制出酶活曲線得出待測物濃度。

  ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。ELISA 實驗中有三種必要的試劑:

 ?、?固相的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上)

  ② 標記的抗原或抗體(標記物)

 ?、?作用的底物(顯色劑,用于顯色)

  四種常見 ELISA方法

  1. 直接 ELISA

  將抗原固定于 ELISA 板上,然后用酶標抗體直檢測抗原。

  相較于其它類型的 ELISA 實驗,直接 ELISA 實驗步驟少,檢測速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應(yīng),測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與 ELISA 板結(jié)合,實驗背景會比較高。而且直接 ELISA  每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號沒有被放大,降低了測定的靈敏度。

  2. 間接 ELISA

  先將抗原結(jié)合到 ELISA 板上,隨后分兩步進行檢測:先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合,隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。

  與直接 ELISA 相比,間接 ELISA 用到酶標二抗,具有更高的靈敏度,也需要更少的標記抗體,更經(jīng)濟。間接 ELISA  還提供了更大的靈活性,因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接 ELISA  實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標二抗直接與抗原結(jié)合),可能會增加背景,同時與直接 ELISA 相比,間接 ELISA  實驗多了二抗孵育的步驟,實驗周期延長。

  3. 夾心 ELISA

  先將捕獲抗體固定于 ELISA 板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體,則可稱為直接夾心  ELISA;如果檢測抗體不帶有標記,則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結(jié)合,這種稱為間接夾心 ELISA。

  夾心 ELISA 的靈敏度高,它比直接或間接 ELISA 敏感 2-5 倍;同時夾心 ELISA  使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,擁有很高的特異性。另外夾心 ELISA 能夠通過直接或間接的方式進行檢測,靈活性較高。夾心 ELISA  的缺點是對配對抗體要求很高,如果沒有標準化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體,則需要進行配對抗體定制并進行優(yōu)化,因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

  4. 競爭 ELISA 法

  預(yù)先將抗原包被在固相載體上,并加入酶標記的特異性抗體。實驗時,加入待檢抗原(或抗體),如果待檢物是抗原,則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標抗體;如果待檢測物是抗體,則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標抗體,加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。

  競爭 ELISA 相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,但以上三種 ELISA 類型都適用于競爭 ELISA  的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,但存在整體敏感性和一性較差的問題。

  ELISA 常見問題與解決方法

  1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

  ① 樣品、試劑被污染,或加樣時操作不當導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。

  ② 酶標板洗滌不——洗板先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。

 ?、?抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當濃度。

  2.酶標板整體背景高

 ?、?抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

  ② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當稀釋。

 ?、?反應(yīng)時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng),適當縮短顯色時間。

  ④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應(yīng)更換新的底物溶液。

 ?、?底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。

  3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

 ?、?樣品數(shù)量不整齊,加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與接近。

  ② 加樣量不一致——樣品稀釋應(yīng)充分混勻,并且使用同一移液槍。

 ?、?洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時,操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

  4. 吸光值偏高或偏低

 ?、?樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

 ?、?加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量。

 ?、?孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間,確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。

 ?、?孵育溫度不適合——應(yīng)抗體在適宜條件下進行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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